Exón

Scientific Reports volumen 6, número de artículo: 18741 (2016) Citar este artículo

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ATM es un importante gen de susceptibilidad al cáncer que codifica una quinasa apical crítica de la vía de respuesta al daño del ADN (DDR). Mostramos que un exón de cambio de desintegración de ARN (NSE) clave mediado sin sentido en ATM está reprimido por U2AF, PUF60 y hnRNPA1. La activación de NSE fue específica de haplotipo y fue promovida principalmente por la citosina en rs609261 en el sitio de empalme 3' de NSE (3'ss), que es predominante en poblaciones con alto riesgo de cáncer. Los niveles de NSE se desregularon en las leucemias y estuvieron influenciados por la identidad del residuo 34 de U2AF35. También identificamos oligonucleótidos de cambio de empalme (SSO) que explotan la competencia de pseudoexones adyacentes para modular los niveles de NSE. El uso del exón regulado por U2AF en la vía de señalización ATM se centró en el eje MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/ciclina-B y preferentemente involucró transcripciones implicadas en fusiones de genes y translocaciones cromosómicas asociadas al cáncer. Estos resultados revelan vínculos importantes entre el control de 3'ss y las respuestas dependientes de ATM a las roturas del ADN de doble hebra, demuestran la plasticidad funcional de las variantes intrónicas e ilustran la versatilidad de los SSO intrónicos que se dirigen a pseudo-3'ss para modificar la expresión génica.

Los intrones son eliminados por un complejo de ARN-proteína grande y altamente dinámico denominado espliceosoma, que organiza interacciones complejas entre transcripciones primarias, pequeños ARN nucleares (snRNA) y una gran cantidad de proteínas1. Los esplicosomas se ensamblan ad hoc en cada intrón de manera ordenada, comenzando con el reconocimiento del sitio de empalme 5' (5'ss) por el ARNsn U1 o el 3'ss por la vía U21,2, que implica la unión del factor auxiliar U2 ( U2AF) a la región 3′ss para facilitar el reconocimiento por U2 de la secuencia del punto de ramificación (BPS)3. U2AF es un heterodímero estable compuesto por una subunidad de 65 kD codificada por U2AF2 (U2AF65), que se une al tracto de polipirimidina (PPT) y una subunidad de 35 kD codificada por U2AF1 (U2AF35), que interactúa con dinucleótidos AG altamente conservados en 3′ ss y estabiliza la unión U2AF654. Además de la unidad BPS/PPT y 3′ss/5′ss, un empalme preciso requiere secuencias o estructuras auxiliares que activen o repriman el reconocimiento del sitio de empalme, conocidas como potenciadores o silenciadores de empalme intrónicos o exónicos. Estos elementos permiten reconocer sitios de empalme genuinos entre un gran exceso de sitios crípticos o pseudositios en el genoma de eucariotas superiores, que tienen secuencias similares pero superan en número a los sitios auténticos en un orden de magnitud5. Aunque a menudo tienen una función reguladora6, los mecanismos moleculares de su represión no se conocen bien.

Los estudios de secuenciación del exoma han revelado un patrón restringido de mutaciones somáticas en U2AF1/U2AF2 y otros genes implicados en el reconocimiento de 3'ss en células cancerosas, incluidos SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B y SRSF2 (revisado en 7). Estos genes codifican productos que a menudo interactúan durante el ensamblaje del espliceosoma8,9,10 y exhiben un alto grado de exclusividad mutua de mutaciones asociadas al cáncer7, lo que apunta a la existencia de una vía oncogénica compartida. El perfil del transcriptoma en leucemias que portan estas mutaciones detectó numerosas alteraciones en el corte y empalme de los precursores del ARNm7, pero los vínculos clave entre defectos específicos en el procesamiento del ARN y el inicio o la progresión del cáncer siguen siendo oscuros, a pesar de la gran promesa de estos objetivos para la modulación terapéutica. Además, no ha quedado claro por qué el patrón de mutación altamente restringido en estas células no se ha asociado con un conjunto limitado y claramente definido de defectos en el procesamiento del ARN con propiedades oncogénicas. Además, el uso de exones en genes DDR, actores críticos en la transformación maligna, no se ha caracterizado completamente en células que carecen de factores de procesamiento 3'ss y se desconocen las variantes naturales del ADN que influyen en su activación.

Aquí, identificamos un exón de cambio de desintegración mediada sin sentido (NMD) reprimido por U2AF en ATM (ataxia-telangiectasia, AT, mutado). Mostramos que el grado en que este evento limita la expresión ATM depende en gran medida de una variante intrónica común rs609261 ubicada en el NSE 3'ss. Al explotar nuevos elementos cis intrónicos que controlan los niveles de inclusión de NSE, identificamos SSO que modulan la activación de NSE al apuntar a un pseudoexón competidor en el mismo intrón. Además, identificamos proteínas relacionadas con U2AF que controlan la selección de NSE. Usando RNA-Seq, también mostramos que la regulación de las vías DDR mediada por U2AF se centra en el eje ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/ciclina-B, lo que sugiere que ha coevolucionado con respuestas celulares a roturas de ADN de doble hebra (DSB). ). Finalmente, demostramos una participación preferencial de las transcripciones reguladas por U2AF en las fusiones de genes y translocaciones cromosómicas asociadas al cáncer.

Nosotros y otros hemos demostrado recientemente que el agotamiento de cada subunidad U2AF resultó en una regulación positiva y negativa de una gran cantidad de exones que estaban empalmados predominantemente de manera alternativa11,12. Al inspeccionar los cambios globales en el procesamiento de ARN en células sin U2AF35, encontramos una activación inesperadamente fuerte de un exón ATM críptico de 29 nt que no fue anotado por RefSeq (denominado NSE para el exón de cambio NMD, Fig. 1a). La activación de NSE también se observó en células desprovistas individualmente de cada isoforma U2AF35 con pequeños ARN de interferencia (ARNip) específicos de isoforma y con SSO dirigidos a 3'ss de los exones Ab y 3 de U2AF1 empalmados alternativamente, que codifican las isoformas U2AF35b y U2AF35a, respectivamente (Fig. .1a). La validación de los datos de RNA-Seq mediante RT-PCR mostró que NSE estaba presente en ~10-20% de las transcripciones poliadeniladas en células 293 de riñón embrionario humano (HEK) no tratadas, similar a los niveles observados en líneas celulares linfoblastoides13. Los niveles de inclusión de NSE aumentaron a ~75% en cultivos con ~90% de U2AF35 agotados y ~50% en células con ~75% de U2AF65 (Fig. 1b), dependieron de la dosis de ARNip y se correlacionaron inversamente con la cantidad estimada de ARNip disponible. Heterodímeros U2AF (Fig. 1c), consistentes con el requisito de cada subunidad U2AF para la represión NSE. Los datos de RNA-Seq también revelaron retención de secuencias intrónicas que rodean a NSE (Fig. 1a) pero no a los intrones adyacentes, lo que sugiere que el intrón 28 está "detenido" y podría empalmarse postranscripcionalmente14. Los niveles de retención del intrón 28 no se vieron afectados por el agotamiento de U2AF35 mediado por SSO ni por ARNip (Fig. 1a) y ningún otro exón críptico en este gen se activó en la misma medida que NSE. Por tanto, NSE juega un papel importante en la regulación exoncéntrica de la expresión de ATM por parte de U2AF.

Identificación de un exón críptico reprimido por U2AF en el intrón 28 de ATM. (a) Esquemas de activación de NSE. La secuencia NSE (panel superior) está encuadrada, el asterisco indica rs609261, los rectángulos negros muestran los oligonucleótidos antisentido indicados. En el panel inferior se muestran las vistas del navegador del genoma de los datos de RNA-Seq de los agotamientos mediados por RNAi o SSO de ambas isoformas U2AF35 (ab-), U2AF35a (a-), U2AF35b (b-) y los controles (c). Los SSO dirigidos a 3′ ss de los exones Ab de U2AF1 y los ARNip 3 y U2AF35 fueron como se describe11. Eje Y, leer densidades. La inclusión/exclusión de NSE se muestra esquemáticamente mediante líneas de puntos en la parte superior. Los exones ATM (cuadros grises) están numerados como en la ref. 13. El NSE de 29 nt introdujo un codón de parada en el ARNm de ATM. (b) Validación de la activación de NSE mediante RT-PCR (panel superior) en agotamientos independientes (panel inferior). Los cebadores de RT-PCR (ATM-F, ATM-R, Tabla S1) se indican mediante flechas en el panel a. Los productos empalmados se muestran a la derecha, el porcentaje de transcripciones con NSE está en la parte superior. Las barras de error indican DE de dos experimentos de transfecciones. ***p < 0,0001, **p < 0,001. (c) La inclusión de NSE en transcripciones maduras se correlaciona inversamente con el U2AF residual. r, correlación de Pearson. Las estimaciones de los niveles de heterodímeros fueron las descritas11.

El examen de las secuencias genómicas que rodean a NSE reveló que la posición -3 en relación con NSE 3'ss es polimórfica en rs609261, donde la timina (T) predomina en las poblaciones africanas y asiáticas y la citosina (C) en los caucásicos (Fig. 2a). La identidad base en esta posición es fundamental para el reconocimiento universal de exones, con una jerarquía CAG>TAG>AAG>GAG de niveles de inclusión de exones en el consenso 3′ss15. Para confirmar que el uso de NSE es específico de alelo, examinamos el empalme de dos construcciones informadoras que contenían C o T en esta posición luego de transfecciones transitorias en células HEK293 (Fig. 2b). Como se esperaba, la construcción T produjo una menor inclusión de NSE que el indicador C, tanto en células no tratadas como en células sin cada subunidad U2AF (Fig. 2c).

La activación de NSE y la expresión ATM se modifican mediante rs609261. (a) Frecuencias alélicas en rs609261 en las poblaciones indicadas66. (b) Esquemas de minigenes. Se clonó un segmento XhoI/XbaI de ATM que contenía NSE y el exón 29 entre los exones 2 y 4 de U2AF1 (cuadros negros). Los cebadores de RT-PCR para amplificar transcripciones exógenas (PL3 y ATM-R, Tabla S1) se indican con flechas. (c) La activación de NSE dependiente de rs609261 en pre-ARNm exógenos. Las células HEK293 empobrecidas en U2AF35 o U2AF65 se transfectaron transitoriamente con minigenes T (negro) y C (gris). La concentración final de los ARNip U2AF35 y U2AF65 fue de 30 y 60 nM, respectivamente. (d) Identificación de líneas celulares homocigotas en rs609261 (asterisco). NSE está encajonado. ( e, f ) La activación alélica específica de NSE en transcripciones endógenas limita la expresión de ATM de una manera dependiente de la dosis. La fuente de transcripciones endógenas está en la parte inferior, los anticuerpos están a la derecha. La concentración de ARNip en cultivos de HEK293 fue de 3, 10 y 30 nM. La concentración de ARNip en cultivos de HeLa fue de 6,6, 20 y 60 nM. C1, C2, ARNip de control. La eficiencia de la transfección se controló mediante un plásmido GFP y microscopía fluorescente. (g) El agotamiento de UPF1 aumentó la activación de NSE (panel superior) y la isoforma U2AF1c regulada positivamente (panel inferior). La isoforma U2AF1c contiene los exones Ab y 3 y está reprimida por NMD11,67. La concentración final del ARNip de UPF1 fue de 7, 20 y 60 nM. SC, un control codificado. Las barras de error son SD de transfecciones independientes. (h) Niveles de inclusión de NSE en células desprovistas de proteínas relacionadas con U2AF y un subconjunto de RNP nucleares heterogéneas. Las barras de error indican SD de dos transfecciones. Las inmunotransferencias se muestran a la derecha. La concentración final del ARNip U2AF35 fue de 25 nM; los ARNip restantes estaban a 60 nM. C, controles. (i) La sobreexpresión de PUF60 indujo la omisión de NSE. Las inmunotransferencias se muestran a continuación, los anticuerpos a la derecha.

Para probar si el uso de NSE específico de alelo da como resultado una expresión diferencial de proteínas en células que carecen de U2AF35, primero secuenciamos el ADN de líneas celulares disponibles en rs609261 para obtener células transfectables homocigotas para cada alelo. Descubrimos que las células HEK293 eran homocigotas para el alelo C y las células HeLa eran homocigotas para el alelo T (Fig. 2d). Las inmunotransferencias de las células empobrecidas en U2AF35 y los controles no tratados confirmaron un agotamiento eficiente en cada línea celular y una mayor disminución de la expresión de ATM mediada por U2AF en presencia del alelo C que el alelo T (Fig. 2e, f y Fig. S1a-c). ). El agotamiento de UPF1, un componente clave de la vía NMD, reveló un aumento dependiente de la dosis de la inclusión de NSE en los ARNm de ATM (Fig. 2g). No se detectó ninguna señal de un supuesto ATM truncado en las inmunotransferencias de células agotadas.

Debido a que los exones reprimidos y activados por U2AF muestran respuestas preferenciales a las proteínas relacionadas con U2AF, agotamos las células HEK293 de PUF60 y CAPERα y también varias ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas, incluida hnRNP A1. PUF60 interactúa con motivos ricos en uridina en 3′ss16 y hnRNP A1 forma un complejo ternario con U2AF en ARN ricos en U que contienen AG17. El agotamiento de PUF60 o hnRNP A1 aumentó la inclusión de NSE (Fig. 2h), mientras que la sobreexpresión de PUF60 provocó la omisión de NSE (Fig. 2i). En conjunto, estos resultados muestran que la activación de NSE rs609261 y dependiente de la población en lo profundo del intrón 28 de ATM está regulada por U2AF, PUF60 y hnRNP A1 y demuestran que la funcionalidad de un polimorfismo intrónico común varía con los niveles celulares de proteínas de unión a ARN que facilitan 3 Es un reconocimiento.

Para probar si la activación de NSE en células que carecen de U2AF se puede reprimir para restaurar la expresión de ATM, primero cotransfectamos individualmente la construcción informadora del alelo C con SSO dirigidos a los sitios de empalme de NSE (Fig. 1a). Los SSO se modificaron con enlaces fosforotioato en cada extremo y con 2′-O-metilo en cada ribosa y se diseñaron para evitar el PPT de NSE, tallos estables predichos por Mfold y rs609261. Cada SSO disminuyó la inclusión de NSE de una manera dependiente de la dosis tanto en transcripciones exógenas (Fig. 3a) como endógenas (Fig. 3b), y el SSO dirigido a NSE 3'ss fue más eficiente que el SSO que une sus 5's al mismo tiempo. concentraciones.

Rescate de la expresión ATM reprimida por U2AF por parte de SSO dirigidos a NSE. ( a, b ) Inhibición eficiente de NSE mediada por SSO en transcripciones ATM exógenas ( a ) y endógenas ( b ). Los niveles medios de inclusión de NSE de dos experimentos de transfección se muestran en los paneles de la derecha. (c) Restauración de los niveles de proteína ATM por parte de los SSO que bloquean el acceso a NSE. Las células que carecen de U2AF35 y las células de control se transfectaron con el SSO dirigido a NSE 3 y un SSO de control (Fig. 1a y Tabla S1), como se describe61,68. Después de 48 horas, las células se expusieron a radiación ionizante (IR, 10 Gy) y se recogieron 1 hora después. Los lisados ​​​​celulares se separaron utilizando un gradiente de SDS-PAGE. La transferencia Western se realizó con anticuerpos que se muestran a la derecha. (d) Mejora mediada por SSO-NSE3 de la proteína ATM en líneas celulares homocigotas en rs609261. Las columnas representan la diferencia promedio en veces en la expresión de ATM entre células homocigotas tratadas con SSO-NSE3 y tratadas con SSO-C empobrecidas en U2AF35. Las barras de error representan la SD de dos réplicas biológicas. Los valores de p que comparan SSO-C con sus homólogos tratados con SSO-NSE3 se muestran en la parte superior. Las inmunotransferencias representativas se encuentran en la Fig. S1a, b.

A continuación, examinamos si el SSO NSE 3'ss puede aumentar la expresión de la proteína ATM. La expresión reducida de ATM en células que carecen de U2AF35 fue parcialmente rescatada por este SSO en células HEK293, pero esto no fue evidente en células HeLa donde la activación y reconstitución de NSE fue menos eficiente con las mismas concentraciones de SSO (Fig. S1a y S1b, carriles 5-8). frente a 9-12; figura S1c). También probamos si el SSO NSE3 puede influir en los objetivos ATM posteriores en células HEK293 expuestas a radiación ionizante (IR). La baja expresión de ATM en células que carecen de U2AF35 fue parcialmente rescatada por este SSO también en células expuestas a IR (Fig. 3c, carriles 1 vs 2 y 5 vs 6 y Fig. S1e, carriles 5–8 vs 9–12). Después de la IR, el ATM activado autofosforilado en S198118 se redujo en las células agotadas en comparación con las células no tratadas (Fig. S1e, carriles 1–4 vs 5–8 y Fig. 3c, carril 6 vs 8) y esta señal también apareció ligeramente aumentada después de la exposición. al SSO NSE 3′ss (Fig. S1e, carriles 5–8 vs 9–12 y Fig. 3c, carril 5 vs 6). También sobreexpresamos CHEK2 de tipo salvaje en células (simuladas) irradiadas (simuladas) empobrecidas de U2AF, una serina / treonina quinasa fosforilada por ATM en T68 en respuesta a DSB19. Las células que carecían de U2AF tenían niveles marcadamente más bajos de CHEK2 endógeno en comparación con los controles, que no parecieron alterarse por el SSO NSE 3'ss (Fig. S1e, carriles 1-12). Por el contrario, la CHEK2 exógena aumentó en las células agotadas, tanto en las células expuestas a IR como en las no expuestas (carriles 1 a 4 frente a 5 a 8, consulte también la figura S1f, g más abajo).

En conjunto, la activación de NSE fue inhibida eficientemente por los SSO que bloquean el acceso a los sitios de empalme de NSE y no admiten la escisión de la RNasa H. El SSO más eficiente rescató parcialmente la inhibición de ATM mediada por NSE.

Para identificar elementos cis reguladores intrónicos que controlan la inclusión de NSE en transcripciones maduras, aprovechamos una mutación AT IVS28-159A> G13 informada previamente. Notamos que esta mutación activó el NSE 3'ss mientras reprimía sus 5's y promovía un 5's aguas abajo, introduciendo un exón críptico de 112 nt en el ARNm13. También notamos que dentro de este exón, hubo un fuerte consenso de 3'ss precedido por motivos BPS/PPT óptimos, que pueden unirse a U2AF y activar un pseudoexón más pequeño de 24 nt (denominado PE; Fig. 4a). El examen de los datos publicados de reticulación de ARN/inmunoprecipitación20 en ATM mostró la unión de U2AF65 aguas arriba y aguas abajo de NSE y aguas arriba de PE, lo que sugiere que la activación de NSE puede controlarse mediante la competencia entre espliceosomas parcialmente productivos ensamblados en PE 3′ss y NSE 3′ss. Los dos 3's se conservan en los mamíferos y están separados por una distancia menor que el tamaño mínimo del intrón, lo que impide estéricamente el reconocimiento simultáneo de NSE y PE (Fig. 4a). La eliminación del PE PPT / 3'ss introducida en el minigen C, que debería aliviar la represión de NSE a través de una disminución de la unión de U2AF a PE, aumentó la inclusión de NSE (Fig. 4b), de acuerdo con la competencia de 3'ss. Esta eliminación también indujo la retención del intrón que separa NSE y PE, imitando el patrón de empalme de la mutación AT IVS28-159A >G. Al aumentar la longitud del intrón de 59 a 79 nt, superando así un obstáculo estérico impuesto por la distancia insuficiente entre los dos pseudo-3's, también mejoró la inclusión de NSE y disminuyó la retención de intrones (Fig. 4b).

Identificación de elementos cis intrónicos y SSO que modulan la activación de NSE. ( a ) Esquemas de dos pseudoexones en el intrón 28 de ATM. Los exones canónicos, NSE y PE se muestran como cuadros grises, blancos y a cuadros, respectivamente. El asterisco indica la ubicación de la sustitución IVS28-159A >G13. En este caso de AT, tanto NSE como PE se incluyeron en el ARNm de ATM junto con la secuencia intermedia. Las transcripciones canónicas y aberrantes se indican mediante líneas de puntos encima y debajo del pre-ARNm. El panel central muestra las densidades de lectura de RNA-Seq para NSE en células sin ambas isoformas U2AF35 (ab-) junto con etiquetas U2AF65/sitios de unión de alta confianza (líneas horizontales/rectángulos) identificados mediante reticulación e inmunoprecipitación20. La conservación de 100 vertebrados básicos de Phylop (100 VC) está en la parte inferior. El panel inferior muestra mutaciones (en rojo y subrayadas) introducidas en el minigén C. ( b ) Patrón de empalme de minigenes C mutados y de tipo salvaje. Las mutaciones se encuentran en la parte inferior del panel (a); Los productos de ARN se muestran esquemáticamente a la derecha. El producto más grande producido por el clon PE delPPT/AG incluye el pseudointrón acortado. (c) Patrón de empalme de minigenes C mutados en NSE (carriles 2, 3, 7 y 8) o PE (carriles 4, 5, 9 y 10) en células HEK293 empobrecidas (simuladas). Las mutaciones están en la parte inferior; sus secuencias están en la Tabla S2. Los productos empalmados se muestran esquemáticamente a la derecha. Un símbolo de horquilla encima de PE indica la inserción del vástago-bucle MIR; cr3'ss, una activación críptica de 3's 7 nt aguas abajo de los auténticos NSE 3's. ( d, e ) Cambio de pseudoexón inducido por SSO. Los minigenes transfectados se muestran en la parte superior, los productos empalmados a la derecha y los SSO en la parte inferior. Las secuencias de SSO se encuentran en la Tabla S1. La concentración final de SSO mostrada en los paneles (d – g) fue de 3, 10 y 30 nM. (f) Los SSO de PE indujeron la omisión de NSE. (g) Los SSO que se dirigen a una secuencia que activa NSE tras la eliminación (PEdelPPT/AG; paneles a y b) inhiben la PE. (h) La activación de NSE depende del haplotipo. Los haplotipos de minigenes en las variantes indicadas se encuentran en la parte inferior. Las columnas representan la inclusión media de NSE, las barras de error son DE y los asteriscos denotan diferencias estadísticamente significativas como en la figura 1b.

Para probar si NSE puede influir en la inclusión de PE en el ARNm, primero eliminamos los NSE 3'ss. La mutación NSE 3'ss activó un críptico 3'ss 7-nt aguas abajo, que tenía un requisito reducido para U2AF (Fig. 4c, carriles 1, 2 y 6, 7, Tabla S2). Debido a que extender el intrón entre NSE y PE en este contexto tampoco logró activar PE (carriles 3 y 8) y debido a que PE carece de potenciadores de empalme exónico y tiene un BPS subóptimo (Tabla S3), insertamos un bucle de tallo de 24 nt derivado de un mamífero. -Repetición intercalada amplia (MIR) en medio de PE. Esta horquilla MIR actúa como un módulo de definición de exón casi universal a través de un potenciador de empalme expuesto en un triloop de ARN terminal21. El PE agrandado se activó fuertemente en células empobrecidas simuladamente, pero NSE lo superó en células que carecían de U2AF35 (carriles 4 y 9), lo que demuestra requisitos diferenciales de los dos pseudoexones para U2AF (35). La construcción que contiene tanto la inserción MIR en PE como el intrón extendido finalmente generó ARNm que contenían tanto NSE como PE (carriles 5 y 10).

A continuación, empleamos este reportero MIR para probar el impacto de los SSO de NSE y PE en el uso de exones y la expresión de ATM. La Figura 4d muestra que el SSO de NSE 3'ss reprimió las transcripciones que contenían NSE y reguló positivamente aquellas con PE, mientras que se encontró el efecto opuesto para los SSO dirigidos al bucle potenciador MIR en PE. Observamos el mismo patrón para el reportero en el que NSE y PE estaban separados por una distancia insuficiente para su inclusión simultánea en el ARNm (Fig. 4e). Estos resultados sugirieron que los SSO dirigidos a PE y/o los sitios de unión U2AF65 aguas arriba de PE pueden promover potencialmente la inclusión de NSE y reducir la expresión de ATM, cancelando los SSO de NSE. Este enfoque podría proporcionar una estrategia más amplia para que los SSO intrónicos modulen la expresión genética en cualquier dirección al apuntar a pseudoexones competitivos, uno de los cuales es fundamental para la regulación genética. Para probar este concepto, examinamos los SSO de PE. Aunque los SSO dirigidos a los sitios de empalme de PE indujeron la omisión de NSE en transcripciones exógenas y endógenas (Fig. 4f), los SSO bloquearon el acceso a los sitios de unión de U2AF65 justo aguas arriba de PE (Fig. 4a), es decir. al motivo represor de NSE identificado en la construcción delPPT / AG (Fig. 4b), se redujo la inclusión de PE y se aumentó ligeramente la NSE en el indicador MIR (Fig. 4g). Un oligo más largo que se extiende en la dirección 5' (SSO-PEBP, Tabla S1) no alteró los niveles de inclusión de NSE.

PE contiene una variante G/A natural rs4988000, que también puede influir en el reconocimiento de NSE (Fig. 4h). Las transfecciones de los minigenes C y T mutados sistemáticamente en rs4988000 revelaron que el raro alelo A en rs4988000 disminuyó la inclusión de NSE en cada pre-ARNm, tanto en células U2AF35 como en células con agotamiento simulado. Así, la mayor inclusión de NSE la produjo el haplotipo más frecuente en caucásicos (CG), seguido de los haplotipos CA >TG > TA.

En conjunto, la activación dependiente del haplotipo de la NSE reprimida por U2AF puede modificarse mediante SSO que se dirigen a motivos reguladores de empalme de pseudo-3's competitivos.

Debido a que ATM es una quinasa apical clave en la vía DDR22 y los exones de cambio NMD alterados por U2AF eran frecuentes en los genes que codifican las parejas de interacción de la proteína U2AF11, caracterizamos sistemáticamente los cambios en el procesamiento del ARN inducidos por U2AF(35) de los sustratos ATM actualmente conocidos23 y otros constituyentes de la Red de señalización de cajeros automáticos24. Curiosamente, aunque los genes implicados en el DDR y el control del ciclo celular que contenían exones dependientes de U2AF(35) estaban sólo marginalmente enriquecidos (FDR = 0,08)11, cada componente en el eje ATM-CHEK2-CDC25-CDC2/ciclina B mostró procesamiento de ARN. alteraciones (Fig. 5a, Fig. S2). Esta vía es fundamental para la señalización ATM de los DSB22.

Regulación exóncéntrica de la señalización ATM. ( a ) Cambios en la expresión a nivel de gen y exón regulados por U2AF en la vía MRN-ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/ciclina B (panel izquierdo). Los valores log2fold y q63 se muestran entre paréntesis. El uso de exones de los genes CHEK2 y CDC25A se muestra mediante tomas del navegador RNA-Seq; Los geles de validación de PCR se encuentran en los paneles de la derecha. El exón 9 de CHEK2 es un exón de cambio de NMD; El exón 11 codifica una porción del dominio quinasa. En la Fig. S2 se muestra el espectro completo de cambios de expresión mediados por U2AF en la vía de señalización ATM; En las figuras S3 a S6 se encuentran ejemplos de la regulación de empalme mediada por U2AF. (b) Señalización ATM deteriorada en células agotadas U2AF35 después de IR. A las células HEK293 se les agotó (simuladamente) U2AF35 y se sometieron a IR (10 Gy) 48 horas después. La expresión se examinó mediante inmunotransferencia en los momentos indicados. Los anticuerpos se muestran a la derecha. Los niveles de omisión del exón 9 de CHEK2 están en la parte inferior; sus mediciones en células de control (U2AF35+) y agotadas (U2AF35-) están en el panel (c). ( d ) Inclusión del exón 9 de CHEK2 en células agotadas en UPF1. La concentración final del ARNip de UPF1 (Tabla S1) fue de 12,5, 25, 50 y 100 nM. (e) La represión del exón 9 de CHEK2 por SSO redujo los niveles de CHEK2 y promovió la inclusión de NSE. La concentración final de SSO dirigido al exón 9 de CHEK2 fue de 3, 10 y 30 nM. ( f ) Inclusión del exón 9 de CHEK2 tras la transfección de células HEK293 con los SSO indicados. ( g ) La falta de SF3B1 indujo la omisión del exón 9 de CHEK2 pero no alteró la activación de NSE. La concentración final de cada ARNip dirigido a SF3B1 fue de 20 nM.

Primero, la expresión reducida de ATM en células que carecen de U2AF (Fig. S1e) se asoció con una disminución del ARNm de CHEK2, una mayor retención del intrón 10 de CHEK2 y la omisión de los exones 9 y 11 (Fig. 5a). Las alteraciones en el procesamiento del ARN de sustratos CHEK2 conocidos se limitaron a los genes que regulan el ciclo celular (CDC25A, CDC25B, CDC25C y TTK; Fig. 5a, S3a,b, S4a) y no fueron evidentes en los genes implicados en la reparación del ADN (BRCA1/2, XRCC1). , FOXM1, TRIM28) o señalización p53 (TP53, MDM4, CABIN1, STRAP, AATF). La omisión del exón 9 de CHEK2, que se predice que activará NMD, aumentó solo marginalmente 24 horas después de la IR y no pareció contribuir a la disminución del CHEK2 total observado tan pronto como 30 minutos después de la IR (Fig. 5b, c). Como la inclusión del exón 9 de CHEK2 aumentó solo para la concentración más alta de ARNip de UPF1 probados (Fig. 5d), transfectamos células HEK293 con un SSO dirigido a sus 3'ss. Este tratamiento indujo la omisión del exón 9 y redujo la expresión de la proteína CHEK2 (Fig. 5e). Los SSO dirigidos a NSE o PE no tuvieron ningún efecto sobre la inclusión del exón 9 de CHEK2 (Fig. 5f). La omisión del exón 9, pero no de la NSE, aumentó drásticamente en las células que carecían de SF3B1 (Fig. 5g). Para abordar por qué la expresión exógena de CHEK2 estaba elevada en células que carecían de U2AF35 en comparación con los controles (Fig. S1e), cotransfectamos células HEK293 con el SSO que reprime CHEK2 y un plásmido que expresa CHEK2 (Fig. S1f, g). La reducción de CHEK2 endógeno se asoció con un aumento significativo de CHEK2 exógeno también en células competentes en U2AF, lo que apunta a una estricta regulación homeostática de la proteína CHEK2 total en la célula.

En segundo lugar, se requirió U2AF para la activación completa del exón 6 de CDC25A (Fig. 5a), que codifica un residuo de serina (S178) fosforilado por CHEK2/CHEK1. También se requirió U2AF (35) para la inclusión del exón 3 de CDC25B y CDC25C (Fig. S3a, b), lo que confirma los datos de microarrays25. El exón 3 de CDC25B codifica múltiples residuos fosforilados, incluido S169; la isoforma fosforilada en S169 se localiza en los centrosomas y se acumula durante la mitosis26. El exón 3 de CDC25C codifica T67 fosforilada por cdc2/ciclina-B como parte del bucle de autoamplificación27. El T67 fosforilado en CDC25C crea un sitio de unión reconocido por el dominio WW de PIN127, que mantuvo la activación de otro exón de cambio NMD reprimido por U2AF (Fig. S4b), posiblemente modificando la actividad catalítica de esta abundante peptidil-prolil isomerasa. Finalmente, los ARNm de ciclina B1 y B2 estaban regulados positivamente en células que carecían de U2AF35, así como de la proteína que interactúa con la ciclina B1 (CCNB1IP1), aunque sus patrones de procesamiento de ARN no parecieron alterados (Fig. 5a). La regulación positiva de la ciclina B se asoció con un intrón CDK1 detenido (Fig. S4c), que puede empalmarse postranscripcionalmente14.

La contratación de cajeros automáticos para DSB se ve facilitada por el complejo MRN, que consta de MRE11, RAD50 y NBN22. NBN no mostró cambios obvios en el procesamiento de ARN en células que carecen de U2AF35, pero el ARNm de RAD50 se reguló negativamente, posiblemente mediante la activación de un exón de cambio NMD y/o alteraciones de empalme adicionales (Fig. S5a-c y Fig. S2). El último exón MRE11A estaba regulado positivamente, posiblemente como resultado de una promoción del sitio de poliadenilación alternativo distal en células agotadas, que se utiliza en la mayoría de los tipos de células, pero no en las células B28. El análisis DEXSeq no detectó cambios significativos en el procesamiento de ARN en las transcripciones que codifican otros miembros de la familia de serina/treonina quinasas similares a la fosfatidilinositol 3 quinasa (ATR y PRKDC), ni en BRCA1/2, RNF168 y el interactor ATMIN. Otros socios que interactúan con ATM con expresión alterada de exones o genes incluyeron RPS6, SRSF1 y otras proteínas SR, EP300, RPA2, BLM, FANCD2 y FANCI, PPP2R5C y PPP2R5D y SMC3, un componente central del complejo de cohesina (Fig. S2).

El agotamiento de U2AF35 se asoció con alteraciones preferenciales de genes/exones implicados en la modificación de la cromatina11, que tienen numerosos vínculos funcionales con la señalización ATM (Fig. S2)22. Por ejemplo, el complejo de remodelación de cromatina INO80 es fosforilado por ATM y está funcionalmente vinculado a reguladores de puntos de control, incluido CHEK229. U2AF inhibió las isoformas de INO80C con exones de 54 nt11, que probablemente estén involucrados en la formación de heterodímeros con ACTR5. El agotamiento de U2AF35 alteró la expresión de múltiples componentes de INO80, incluidos ACTR5, ACTL6A y RUVL2B11. Muchas subunidades de INO80 también están ubicadas preferentemente en los telómeros30. Se requirió U2AF para la inclusión completa del exón 7 de TERF1 en el ARNm (Fig. S6a), controlando así la abundancia relativa de las isoformas TRF1 (exón 7+) / PIN2 (exón 7-), componentes importantes del complejo de refugio que protege los telómeros. El exón 7 codifica múltiples residuos de serina fosforilados y ambas isoformas pueden heterodimerizarse a través del dominio de dimerización31. La inhibición de ATM también promueve la unión de TRF1 a los telómeros, mientras que la fosforilación mediada por ATM perjudica la interacción de TRF1 con el ADN telomérico32. La asociación de TRF1 con los telómeros también está regulada negativamente por RAD5032. TIF2 que interactúa con TRF1, otra proteína de refugio localizada en la matriz nuclear, existe en al menos dos isoformas producidas por empalme alternativo, denominadas TIN2S y TIN2L33. TIN2L contiene un dominio de unión a NM adicional y se asocia más fuertemente con la matriz nuclear que TIF2S¸que está codificado por una transcripción con intrones 3' retenidos que forman una región 3' larga no traducida33. Esta isoforma de ARNm fue reprimida por U2AF (Fig. S6b).

En conjunto, estos resultados muestran que el eje MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/ciclina B está en el centro del control de DDR mediado por U2AF(35), aunque la regulación U2AF se extiende a sustratos ATM adicionales, principalmente involucrados en la cromatina. Modificación y actividad de los telómeros.

CHEK2 fosforila la PML (leucemia promielocítica) y parece requerir PML para la autofosforilación posterior34. El agotamiento de U2AF35 promovió el uso del sitio de poliadenilación alternativo proximal de PML, lo que llevó a la regulación positiva de la isoforma de PML más corta, que carece del último exón que codifica la señal de exportación nuclear (Fig. S7a). Las isoformas de PML larga y corta tienen funciones distintas; por ejemplo, las isoformas nucleares de PML, pero no la isoforma citoplasmática, son reguladores positivos de la señalización de IFNγ35. El extremo C de la isoforma más larga interactúa específicamente con AML1 para mejorar la transcripción mediada por AML1, lo que sugiere que la deficiencia de U2AF podría afectar las interacciones PML-AML1. PML también se une a PIN1 y esta interacción promueve la degradación de PML de una manera dependiente de la fosforilación37. El agotamiento de U2AF aumentó un exón PIN1 NMD (Fig. S4b), lo que potencialmente limita la expresión de esta abundante isomerisa de peptidil-prolil, que interactúa con muchas fosfoproteínas para regular la mitosis, incluida la CDC2538 fosforilada. Además de PML, el agotamiento de U2AF35 reguló positivamente a otros socios de RARA, incluido NPM1 (Fig. S7b). Este evento se asoció con la promoción de un sitio de poliadenilación proximal y aumentó la abundancia de transcripciones más cortas. Un exón de BCOR empalmado alternativamente, un correpresor de BCL6 que forma fusiones BCOR-RARA e interactúa con varias histonas desacetilasas para aumentar la represión transcripcional de BCL6, también se reguló negativamente (Fig. S7c).

Curiosamente, la superposición entre genes/exones sensibles a U2AF35 y 1.187 genes implicados en fusiones de genes asociados al cáncer41 y 300 genes implicados en translocaciones cromosómicas recurrentes42 fue mayor de lo esperado, con valores de P más significativos para genes con exones utilizados diferencialmente que aquellos implicados por el Algoritmo de gemelos (Tabla 1). De manera similar, el intercambio de genes frecuentemente mutados en el síndrome mielodisplásico43 y los genes expresados ​​diferencialmente tras el agotamiento de U2AF3511 fue significativamente mayor de lo esperado (P <0,01, prueba hipergeométrica). Por lo tanto, el procesamiento de ARN de transcripciones implicadas en fusiones de genes y translocaciones de cromosomas asociados al cáncer está regulado preferentemente por U2AF.

Para probar la función de las mutaciones U2AF1 asociadas al cáncer en el empalme NSE, realizamos experimentos de reconstitución con construcciones U2AF35 de tipo salvaje y mutadas que se cotransfectaron con el minigén C en células (simuladas) agotadas de U2AF35 (Fig. 6). La activación de NSE fue reprimida por la isoforma U2AF35 en un grado similar, así como por U2AF35a que contiene sustituciones de S34 asociadas al cáncer en el dominio 1 del dedo de zinc, el residuo U2AF35 mutado con mayor frecuencia en el cáncer. Por el contrario, sólo se logró un rescate parcial mediante sustituciones de Q157 en el segundo dominio del dedo de zinc, donde estas mutaciones son menos frecuentes. Otras mutaciones de S34 no lograron reconstituir completamente el defecto, incluido S34T y sustituciones con aminoácidos pequeños, aunque un residuo grande en esta posición (S34R) fue eficiente, lo que sugiere que el tamaño de este residuo es crítico para la unión del ligando. Por tanto, la identidad del residuo en la posición 34 de U2AF35 era importante para el reconocimiento de NSE.

Rescate de la represión de la NSE por mutaciones asociadas al cáncer en U2AF35. Rescate del empalme NSE dependiente de U2AF(35) del minigen C mediante sustituciones de dedos de zinc 1 y 2 en U2AF35 (panel superior). Todas las sustituciones se realizaron en el constructo U2AF1a (35a)11. Las mutaciones asociadas al cáncer (abajo) están encuadradas; los productos de empalme están a la derecha. Las barras de error son SD de 2 transfecciones. En el panel inferior se muestra la inmunotransferencia con anticuerpos U2AF35 y GFP; ex, exógeno; es, U2AF35 endógeno.

Finalmente, detectamos un bajo grado de activación de NSE en diversos tejidos humanos, tanto en muestras preparadas con hexámero como en transcripciones poliadeniladas (Fig. S8a). La proporción de ARN que contenían NSE fue en promedio mayor en las células leucémicas que en las células normales, y algunas muestras mostraron niveles muy altos (Fig. S8b, c), lo que podría contribuir a una reducción de la expresión de ATM en las células cancerosas. También examinamos la inclusión de NSE en ARN poliadenilados extraídos de un panel de líneas celulares linfoblastoides expuestas a choque frío y térmico a las temperaturas indicadas antes de la lisis (Fig. S8d, e). Curiosamente, la NSE se activó en menor medida al exponer las células a 42 °C, pero no a temperaturas subfisiológicas (Fig. S8d), lo que sugiere que es poco probable que los niveles de inclusión de NSE notablemente más altos en las células malignas se expliquen por un choque frío encontrado durante el almacenamiento de muestras de los pacientes. Dado que el perfil proteómico de las células Jurkat expuestas a un estrés térmico a 43 °C reveló una expresión disminuida de varias proteínas, incluida U2AF35a44, estos resultados respaldan aún más a U2AF35 como un represor específico de NSE.

Aquí hemos identificado un exón de interruptor NMD acoplado por empalme alternativo crítico para la expresión de ATM (Fig. 1 y 3) y examinamos su importancia en el riesgo de cáncer (Fig. 2, Fig. 6 y S8). También hemos demostrado cómo la inclusión de este exón en transcripciones maduras está influenciada por haplotipos intrónicos y proteínas de unión a ARN involucradas en la selección de 3'ss (Fig. 2 y 4h). Finalmente, identificamos SSO que modulan la activación de este exón al dirigirse a sus secuencias reguladoras y propusimos una nueva estrategia antisentido para modificar la expresión génica. Estos resultados amplían significativamente los vínculos actualmente conocidos entre el procesamiento de ARN y las vías de DDR (Fig. 5 y S2).

Los exones reprimidos por U2AF tienen una organización 3'ss distinta y una respuesta a las proteínas relacionadas con U2AF en comparación con los exones activados por U2AF11, lo que sugiere que la represión NSE implica la unión directa de ARN. Esto está respaldado por la activación de NSE observada en transcripciones exógenas que no sufren NMD y por el bloqueo de NSE inducido por SSO (Figs. 2 y 4). NSE carece de dinucleótidos AG entre el BPS y 3′ss previstos, su zona de exclusión de AG es más larga que el promedio y tiene un tramo inusual de 5 guaninas conservadas aguas arriba del BPS, lo que puede contribuir a estructuras secundarias estables a lo largo de 3′ss que podrían ser requerida para la inhibición. Las porciones 3 'ricas en adenina tanto de NSE como de PE están más conservadas en la evolución que sus partes 5' (Fig. 4a), lo que potencialmente proporciona interacciones de ligando importantes, dada la propensión de la adenina a ocupar posiciones no apareadas en los ARN estructurados. Aunque la unión directa al ARN parece ser la explicación más simple para la represión del exón por parte de U2AF, el agotamiento de U2AF35 condujo a una regulación negativa de varias proteínas involucradas en NMD (Tabla S4), lo que puede contribuir a la activación de NSE en transcripciones endógenas. Las interacciones físicas entre U2AF65 y el extremo C de TRF145 u otros componentes de la red de señalización ATM46 también podrían participar en la regulación de NSE. Un desafío futuro será comprender mejor los mecanismos de represión de NSE en células normales y cancerosas donde el control de NSE parece estar comprometido, alterando potencialmente la expresión de ATM y DDR de manera dependiente del haplotipo (Fig. 2 y S8b, c).

Además de U2AF1/U2AF2, se han encontrado mutaciones en el cáncer de genes adicionales implicados en la selección 3'ss. Curiosamente, las leucemias linfocíticas crónicas con mutación SF3B1 se asociaron con una activación críptica 3'ss del exón 46 de ATM, lo que llevó al truncamiento de ATM47. El empalme de un exón EZH2 como resultado de una mutación SRSF2 asociada al cáncer estuvo implicado en una diferenciación hematopoyética alterada y el mismo exón NMD también se reguló positivamente en células que carecen de U2AF35 (Fig. S5d). Queda por establecer si estos exones son objetivos de una vía común de reconocimiento de 3's que subyace a la leucemogénesis.

Debido a que la activación de NSE puede restringir la expresión de ATM tanto en células normales como en células cancerosas (Fig. 1, 2 y S8) y ATM es un factor limitante en la vía DDR22, la citosina en rs609261 puede conferir una deficiencia relativa de ATM también en la línea germinal. La actividad de la ATM quinasa parece ser un buen predictor de la gravedad de la AT; sin embargo, la diversidad de los alelos AT no explica completamente el espectro de síntomas clínicos, lo que justifica el papel de factores adicionales49. Nuestros resultados sugieren que los genes implicados en la activación de NSE y las variantes naturales que modulan la inclusión de NSE (Figs. 1, 2c-f y 4h) podrían modificar la complejidad fenotípica de AT y también de los heterocigotos AT que carecen de características clínicas manifiestas pero que pueden mostrar una mayor radiosensibilidad y riesgo de cáncer50. es decir. fenotipos influenciados por la vía crítica regulada por U2AF en la red de señalización ATM (Fig. S2). Aunque la represión inducida por SSO de las transcripciones endógenas de NSE se observó también en células no tratadas (Fig. 3b) y las transcripciones de NMD con una abundancia relativa tan baja como ~1% pueden contribuir dramáticamente al consumo de ARNm51, queda por probar si su reducción puede conducir a un aumento sostenido de los niveles de proteína ATM. Este enfoque puede tener el potencial de aliviar las consecuencias fenotípicas de los alelos AT con fugas de una manera independiente de la mutación, particularmente en pacientes portadores del alelo C en rs609261.

Nuestros resultados también muestran que la activación de NSE es, en promedio, más eficiente en poblaciones caucásicas que en asiáticas como resultado de la mayor frecuencia del alelo C en rs609261 en las primeras (Fig. 2). Este control diferencial de la ENE puede contribuir potencialmente a tasas de mortalidad persistentemente más bajas por neoplasias malignas comunes en las poblaciones asiáticas que en las caucásicas52,53. rs609261 está solo ~35 kb aguas abajo de rs2235006, que se encuentra en una región de recombinación meiótica mínima54 y se asoció con un alto riesgo (OR 11,2) de leucemia linfocítica crónica55. Este estudio genotipó 1467 SNP codificantes no sinónimos en 865 genes candidatos e implicó variantes en genes que codifican el eje DDR ATM-BRCA2-CHEK2 como la vía de riesgo más importante. También se encontró que los pacientes asiáticos con cáncer exhibían una menor prevalencia de algunas fusiones genéticas que los caucásicos56, lo que potencialmente refleja su capacidad para responder a los DSB.

Nuestro estudio también destaca las limitaciones actuales de la anotación de transcripciones incompletas y la importancia de examinar exones crípticos en los datos de RNA-Seq. Aunque RNA-Seq es una herramienta poderosa para examinar el transcriptoma global, aún no se han implementado estándares rigurosos que evalúen correctamente la importancia biológica y estadística de las alteraciones observadas en el procesamiento del ARN. Dada la alta rigurosidad del algoritmo DEXSeq predeterminado11,57, no podemos excluir la existencia de eventos de procesamiento de ARN biológicamente importantes adicionales regulados por U2AF. Por ejemplo, la promoción de un sitio de poliadenilación proximal en CHEK1 en células agotadas junto con la regulación positiva de los exones de 24 y 27 nt en CLASP1, eventos observados en navegadores genómicos, implicaría la vía apoptótica ATM. Esta vía es de particular interés en el síndrome mielodisplásico donde los progenitores mieloides muestran susceptibilidad al programa de muerte celular, las mutaciones en los genes de reconocimiento 3'ss son particularmente frecuentes7 y la desregulación de genes implicados en la señalización ATM se asocia con estadios clínicos más avanzados58. Curiosamente, se descubrió que las mutaciones U2AF1 eran más frecuentes en etapas posteriores y se asociaban con una supervivencia más corta59.

Finalmente, nuestro trabajo demuestra una represión eficiente de un exón de cambio NMD crítico en ATM por parte de SSO que se dirigen a motivos reguladores de pseudoexones competitivos y son capaces de aumentar los niveles de proteína ATM (Figs. 3a-d, 4 y S1). La estrategia propuesta se puede combinar con la edición del genoma como CRISPR-Cas9 para alterar los motivos reguladores de empalme o los sitios de unión de proteínas en los intrones y también debería ayudarnos a encontrar SSO intrónicos eficientes con los resultados deseados para el procesamiento de ARN. La búsqueda de tales SSO es más desafiante que la de aquellos dirigidos a exones humanos. Por ejemplo, la mayoría de los SSO que cubren sistemáticamente el exón 7 de SMN2 estimularon la omisión de exón, que es necesaria para la terapia antisentido de la atrofia muscular espinal; sin embargo, aproximadamente un 20% aumentó la inclusión de exón60. Por el contrario, la estimulación del empalme de intrones se encontró solo en ~10% de los SSO dirigidos al intrón 1 del INS, mientras que la mayoría no logró mostrar este efecto61. La versatilidad de los SSO intrónicos o exónicos para modular el empalme en cualquier dirección explota un contenido de información mucho mayor de las secuencias de empalme auxiliares en humanos en comparación con los organismos inferiores. Por lo tanto, las futuras estrategias de diseño de SSO deberían verse facilitadas en gran medida por estudios globales de plegamiento previo al ARNm, entrecruzamiento del ARN e inmunoprecipitación. Por ejemplo, a diferencia del SSO que bloqueó eficientemente el NSE 3'ss (SSO-NSE3, Fig. 3a, b), un morfolino parcialmente superpuesto que se extiende solo 7 nt en NSE no logró reprimir los mismos 3'ss para rescatar el empalme de la mutación. IVS28-159A>G62, a pesar de apuntar a los sitios de unión U2AF (Fig. 4a). Esto sugiere que el morfolino bloqueó el acceso a estructuras o motivos que no son responsables de la activación del exón, sino de la represión del exón, de acuerdo con nuestro hallazgo (Fig. 1a-c). Por lo tanto, la administración de activadores o inhibidores del procesamiento de ARN antisentido que se dirigen o evitan los sitios de unión de los factores de empalme en los intrones podría explotarse terapéuticamente para dar forma a las consecuencias beneficiosas o perjudiciales de la NMD en las células cancerosas.

Los minigenes ATM se prepararon mediante la clonación de amplicones de aproximadamente 0,9 kb en sitios XhoI/XbaI de la construcción U2AF1 descrita anteriormente11. Los cebadores de clonación se muestran en la Tabla S1. Se secuenciaron las inserciones completas para confirmar la identidad de los cambios previstos y excluir mutaciones no deseadas. El vector de expresión PUF60 se describió previamente11. La construcción hnRNP A1 fue un generoso regalo de Gideon Dreyfuss (Universidad de Pensilvania).

Los cultivos celulares se mantuvieron en condiciones estándar en DMEM suplementado con suero de ternera bovino al 10% (v/v) (LifeTechnologies). El agotamiento de las subunidades U2AF y las isoformas U2AF35 con pequeños ARN de interferencia (siRNA) y oligonucleótidos de cambio de empalme (SSO) se llevó a cabo siguiendo un experimento en el tiempo que estableció los niveles de agotamiento de cada isoforma, como se describe11. Todos los oligo(ribo)nucleótidos se enumeran en la Tabla S1. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 6 o 12 pocillos utilizando jetPRIME (Polyplus) según las recomendaciones del fabricante, como se describe en detalle11. Las células se recogieron 48 horas después del segundo impacto, excepto las expuestas a IR, que recibieron un solo impacto. Para el agotamiento de SF3B1, las células HEK293 se expusieron a una mezcla de ARNip (S23850, S23852, S223598, LifeTechnologies) y se recolectaron 48 horas después.

El análisis del uso diferencial de exones se realizó utilizando DEXSeq (v. 1.12.1)57, basado en valores q inferiores a 0,05, como se describe en detalle11. La expresión diferencial de genes e isoformas entre conjuntos de muestras replicadas se analizó con Cufflinks (v. 2.1.1)63, que normaliza las lecturas utilizando una medida de fragmentos por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas. La selección de genes expresados ​​de manera significativamente diferencial se realizó sobre la base de valores de P ajustados por FDR (q <0,05). Las células, la extracción de ARN y la preparación de la biblioteca se realizaron como se describió anteriormente11.

El panel de encuesta de ARN total humano FirstChoice que contiene muestras de ARN total de 19 tejidos diferentes se adquirió de LifeTechnologies. Cada muestra de tejido contenía un conjunto de ARN de diferentes donantes. Líneas celulares linfoblastoides expuestas a choques de frío y calor se describieron previamente64. Las muestras de ARN total se transcribieron de forma inversa con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina Moloney (Promega) y cebadores hexámeros aleatorios u oligo-d(T). Las muestras de ADNc se amplificaron utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla S1. El ARN total extraído de leucocitos de muestras de médula ósea de pacientes seleccionados al azar con leucemia mieloide aguda o leucemia mielomonocítica crónica se transcribió de forma inversa con cebadores hexámeros aleatorios. El estudio fue aprobado por el Comité Suroeste del Servicio Nacional de Ética de Investigación (Reino Unido).

Los SSO se diseñaron para maximizar las interacciones con regiones monocatenarias21 y evitar estructuras secundarias predichas por Mfold65. Todos los SSO se adquirieron en Eurofins, se diluyeron en agua y sus alícuotas se almacenaron a -80 °C. Sus secuencias se encuentran en la Tabla S1. Todas las transfecciones se llevaron a cabo con jetPRIME (Polyplus) según las recomendaciones del fabricante.

Las células HEK293 agotadas (simuladas) se expusieron a IR 48 horas después del primer impacto utilizando un sistema de rayos X de ortovoltaje D3225 de Gulmay Medical (X-Strahl) a una tasa de dosis de 0,63 Gy min-1 a temperatura ambiente. La tasa de dosis real se controló mediante un medidor de constancia. Las células se recogieron como se indica en las leyendas de las figuras.

La preparación de lisados ​​celulares y la inmunotransferencia se llevaron a cabo como se describe11. Los anticuerpos contra ATM (D2E2), ATM-pS1981 (D6H9), CHEK2 (D9C6) y CHEK2pThr68 (C13C1) se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. Los anticuerpos RBM39 (CAPERa) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (PA5-31103). Los anticuerpos que detectan la etiqueta X-press, U2AF35, U2AF65 y tubulina fueron los descritos anteriormente11. La inmunotransferencia de SF3B1 y FUBP1 se realizó con anticuerpos anti-SAP155 (D138-3, MBL) y anti-FBP (GTX104579, GeneTex), respectivamente. La intensidad de la señal ATM se midió mediante densitometría utilizando ChemiDoc XRS (BioRad) y diluciones en serie de lisados ​​combinados en SDS-PAGE para determinar el rango dinámico lineal de la carga de proteínas. La señal densitométrica se normalizó a la proteína total transferida por transferencia (Fig. S1a, b) ya que el agotamiento de U2AF35 altera la expresión de cientos de exones, muchos de ellos en genes de mantenimiento11.

Cómo citar este artículo: Kralovicova, J. et al. La regulación exoncéntrica de la expresión de ATM depende de la población y es susceptible de modificación antisentido mediante la focalización en pseudoexones. Ciencia. Rep. 6, 18741; doi: 10.1038/srep18741 (2016).

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Wahl, MC, Will, CL y Luhrmann, R. El espliceosoma: principios de diseño de una máquina RNP dinámica. Celda 136, 701–718 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shcherbakova, I. et al. Vías alternativas de ensamblaje de espliceosoma reveladas mediante microscopía de fluorescencia de molécula única. Representante celular 5, 151-165 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zamore, PD & Green, MR Identificación, purificación y caracterización bioquímica del factor auxiliar de ribonucleoproteína nuclear pequeña U2. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 86, 9243–9247 (1989).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, S., Romfo, CM, Nilsen, TW y Green, MR Reconocimiento funcional del sitio de empalme 3 'AG mediante el factor de empalme U2AF35. Naturaleza 402, 832–835 (1999).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Sun, H. & Chasin, LA Múltiples defectos de empalme en un exón falso intrónico. Mol. Celúla. Biol. 20, 6414–6425 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lei, H. & Vorechovsky, I. Identificación de silenciadores y potenciadores de empalme en el sentido Alus: un papel de los pseudoaceptores en la represión del sitio de empalme. Mol. Celúla. Biol. 25, 6912–6920 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoshida, K. & Ogawa, S. Mutaciones del factor de empalme y cáncer. Wiley Interdiscip Rev ARN 5, 445–459 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, JY & Maniatis, T. Interacciones específicas entre proteínas implicadas en la selección del sitio de empalme y el empalme alternativo regulado. Celda 75, 1061–1070 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gozani, O., Potashkin, J. y Reed, R. Un papel potencial de las interacciones U2AF-SAP 155 en el reclutamiento de U2 snRNP en el sitio de la sucursal. Mol. Celúla. Biol. 18, 4752–4760 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hegele, A. y col. Cableado dinámico de interacción proteína-proteína del espliceosoma humano. Mol. Celda 45, 567–580 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kralovicova, J., Knut, M., Cross, NC y Vorechovsky, I. La identificación de exones dependientes de U2AF (35) mediante RNA-Seq revela un vínculo entre la organización del sitio de empalme 3 ′ y la actividad de las proteínas relacionadas con U2AF. Ácidos nucleicos res. 43, 3747–3763 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shao, C. y col. Mecanismos para que U2AF defina sitios de empalme 3 'y regule el empalme alternativo en el genoma humano. Nat. Estructura. Mol. Biol. 21, 997–1005 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coutinho, G. et al. Importancia funcional de una mutación intrónica profunda en el gen ATM y evidencia de un exón 28a alternativo. Tararear. Mutación. 25, 118-124 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Boutz, PL, Bhutkar, A. y Sharp, PA Los intrones detenidos son una clase novedosa y generalizada de intrones empalmados postranscripcionalmente. Desarrollo de genes. 29, 63–80 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Smith, CW, Chu, TT y Nadal-Ginard, B. El escaneo y la competencia entre AG están involucrados en la selección del sitio de empalme 3 'en intrones de mamíferos. Mol. Celúla. Biol. 13, 4939–4952 (1993).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Page-McCaw, PS, Amonlirdviman, K. & Sharp, PA PUF60: una nueva actividad de empalme relacionada con U2AF65. ARN 5, 1548-1560 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tavanez, JP, Madl, T., Kooshapur, H., Sattler, M. & Valcarcel, J. hnRNP A1 corrige el reconocimiento del sitio de empalme 3 ′ por parte de U2AF. Mol. Celda 45, 314–329 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bakkenist, CJ & Kastan, MB El daño del ADN activa ATM mediante autofosforilación intermolecular y disociación de dímeros. Naturaleza 421, 499–506 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Matsuoka, S. y col. La mutación de Ataxia telangiectasia fosforila Chk2 in vivo e in vitro. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 97, 10389–10394 (2000).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zarnack, K. y col. La competencia directa entre hnRNP C y U2AF65 protege el transcriptoma de la exonización de los elementos Alu. Celda 152, 453–466 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kralovicova, J., Patel, A., Searle, M. y Vorechovsky, I. El papel de los bucles cortos de ARN en el reconocimiento de un exón de horquilla única derivado de una repetición intercalada en todo el mamífero. ARN Biol 12, 54–69 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Shiloh, Y. & Ziv, Y. La proteína quinasa ATM: regulación de la respuesta celular al estrés genotóxico y más. Nat. Rev. Mol. Celúla. Biol. 14, 197–210 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Matsuoka, S. y col. El análisis de sustratos ATM y ATR revela extensas redes de proteínas que responden al daño del ADN. Ciencia 316, 1160–1166 (2007).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Paz, A. et al. SPIKE: una base de datos de vías de señalización humana altamente seleccionadas. Ácidos nucleicos res. 39, D793–799 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pacheco, TR, Moita, LF, Gomes, AQ, Hacohen, N. & Carmo-Fonseca, M. La eliminación de la interferencia de ARN de hU2AF35 altera la progresión del ciclo celular y modula el empalme alternativo de las transcripciones de Cdc25. Mol. Biol. Celda 17, 4187–4199 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mirey, G. et al. CDC25B fosforilado por pEg3 se localiza en el centrosoma y los polos del huso en la mitosis. Ciclo celular 4, 806–811 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Perdiguero, E. & Nebreda, AR Regulación de la actividad de Cdc25C durante la transición meiótica G2/M. Ciclo celular 3, 733–737 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lianoglou, S., Garg, V., Yang, JL, Leslie, CS y Mayr, C. Los genes transcritos de forma ubicua utilizan la poliadenilación alternativa para lograr una expresión específica de tejido. Desarrollo de genes. 27, 2380–2396 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morrison, AJ y cols. La fosforilación de Mec1/Tel1 del complejo de remodelación de cromatina INO80 influye en las respuestas del punto de control del daño del ADN. Celda 130, 499–511 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yu, EY et al. Regulación de la estructura y funciones de los telómeros por subunidades del complejo remodelador de cromatina INO80. Mol. Celúla. Biol. 27, 5639–5649 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shen, M., Haggblom, C., Vogt, M., Hunter, T. & Lu, KP La caracterización y regulación del ciclo celular de las proteínas teloméricas humanas relacionadas Pin2 y TRF1 sugieren un papel en la mitosis. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 94, 13618–13623 (1997).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Y., Xiao, S. & Zhu, XD MRE11-RAD50-NBS1 y ATM funcionan como co-mediadores de TRF1 en el control de la longitud de los telómeros. Nat. Estructura. Mol. Biol. 14, 832–840 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kaminker, PG, Kim, SH, Desprez, PY y Campisi, J. Una nueva forma de la proteína TIN2 asociada a los telómeros se localiza en la matriz nuclear. Ciclo celular 8, 931–939 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yang, S. y col. La leucemia promielocítica activa Chk2 mediando la autofosforilación de Chk2. J. Biol. Química. 281, 26645–26654 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

El Bougrini, J., Dianoux, L. y Chelbi-Alix, MK PML regula positivamente la señalización del interferón gamma. Biochimie 93, 389–398 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nguyen, LA y cols. Vínculo físico y funcional de los factores asociados a la leucemia AML1 y PML. Sangre 105, 292–300 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Reineke, EL et al. La degradación del supresor de tumores PML por Pin1 contribuye al fenotipo canceroso de las células MDA-MB-231 del cáncer de mama. Mol. Celúla. Biol. 28, 997–1006 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Litchfield, DW, Shilton, BH, Brandl, CJ y Gyenis, L. Pin1: Participación íntima con las redes reguladoras de proteína quinasa en el panorama global de la fosforilación. Biochim. Biofísica. Actas 1850, 2077–2086 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yamamoto, Y. et al. BCOR como un nuevo compañero de fusión del receptor alfa del ácido retinoico en la variante at(X;17)(p11;q12) de la leucemia promielocítica aguda. Sangre 116, 4274–4283 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Huynh, KD, Fischle, W., Verdin, E. y Bardwell, VJ BCoR, un nuevo correpresor involucrado en la represión de BCL-6. Desarrollo de genes. 14, 1810–1823 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, P. y col. ChimerDB 2.0: una base de conocimientos actualizada sobre genes de fusión. Ácidos nucleicos res. 38, D81–85 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Mitelman, F., Johansson, B. & Mertens, F. El impacto de las translocaciones y fusiones genéticas en la causa del cáncer. Nat. Rev. Cáncer 7, 233–245 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Papaemmanuil, E. y col. Implicaciones clínicas y biológicas de las mutaciones conductoras en los síndromes mielodisplásicos. Sangre 1221, 3616–3627 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Yuan, X. y col. Perfil de proteínas nucleares de células Jurkat durante la apoptosis inducida por estrés térmico mediante 2-DE y MS/MS. Electroforesis 28, 2018-2026 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kim, J. & Chung, IK El factor de empalme U2AF65 estabiliza la proteína TRF1 al inhibir su proteólisis dependiente de ubiquitina. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 443, 1124-1130 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Choi, HH y cols. La quinasa CHK2 promueve el empalme del pre-ARNm mediante la fosforilación de CDK11p110. Oncogén 33, 108-115 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ferreira, PG et al. La caracterización del transcriptoma mediante secuenciación de ARN identifica una subdivisión molecular y clínica importante en la leucemia linfocítica crónica. Genoma Res. 24, 212–226 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, E. y col. Las mutaciones de SRSF2 contribuyen a la mielodisplasia mediante efectos específicos de mutantes en el reconocimiento de exones. Célula cancerosa 27, 617–630 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taylor, AM, Lam, Z., Last, JI & Byrd, PJ Ataxia telangiectasia: más variación a nivel clínico y celular. Clínico. Gineta. 87, 199–208 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Scott, SP, Bendix, R., Chen, P., Dork, T. y Lavin, MF Las mutaciones sin sentido, pero no las variantes alélicas, alteran la función de ATM por interferencia dominante en pacientes con cáncer de mama. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 99, 925–930 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spellman, R. y col. Regulación de empalmes alternativos por PTB y factores asociados. Bioquímica. Soc. Trans. 33, 457–460 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aizer, AA y col. Falta de reducción de las disparidades raciales en la mortalidad específica por cáncer durante un período de 20 años. Cáncer 120, 1532-1539 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Shirley, MH, Sayeed, S., Barnes, I., Finlayson, A. y Ali, R. Incidencia de neoplasias malignas hematológicas por grupo étnico en Inglaterra, 2001-7. Hno. J. hematol. 163, 465–477 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Bonnen, PE y cols. Los haplotipos en ATM identifican la variación de la secuencia de codificación e indican una región de desequilibrio de ligamiento extenso. Soy. J. Hum. Gineta. 67, 1437-1451 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudd, MF, Sellick, GS, Webb, EL, Catovsky, D. y Houlston, RS Las variantes en el eje ATM-BRCA2-CHEK2 predisponen a la leucemia linfocítica crónica. Sangre 108, 638–644 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Magi-Galuzzi, C. et al. La prevalencia y la clase de la fusión del gen TMPRSS2-ERG son diferencias significativas en el cáncer de próstata de pacientes caucásicos, afroamericanos y japoneses. Próstata 71, 489–497 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Anders, S., Reyes, A. y Huber, W. Detección del uso diferencial de exones a partir de datos de RNA-seq. Genoma Res. 22, 2008-2017 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pellagatti, A. et al. Vías de expresión génica desreguladas en células madre hematopoyéticas del síndrome mielodisplásico. Leucemia 24, 756–764 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Makishima, H. y col. Mutaciones en la maquinaria del espliceosoma, una vía novedosa y ubicua en la leucemogénesis. Sangre 119, 3203–3210 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hua, Y., Vickers, TA, Baker, BF, Bennett, CF y Krainer, AR Mejora de la inclusión del exón 7 de SMN2 mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos al exón. PLoS Biol 5, e73 (2007).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kralovicova, J. y col. El objetivo antisentido óptimo que reduce la retención del intrón 1 del INS es adyacente a un cuádruplex G paralelo. Ácidos nucleicos res. 42, 8161–8173 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Du, L., Pollard, JM y Gatti, RA Corrección de mutaciones de empalme ATM prototípicas y función ATM aberrante con oligonucleótidos morfolino antisentido. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 104, 6007–6012 (2007).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trapnell, C. y col. Análisis diferencial de expresión de genes y transcripciones de experimentos de RNA-seq con TopHat y Cufflinks. Nat. Protocolo. 7, 562–578 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kralovicova, J., Houngninou-Molango, S., Kramer, A. y Vorechovsky, I. Haplotipos de sitios de sucursales que controlan el empalme alternativo. Tararear. Mol. Gineta. 13, 3189–3202 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zuker, servidor web M. Mfold para predicción de hibridación y plegamiento de ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos res. 31, 3406–3415 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Consorcio., TGP Un mapa integrado de variación genética de 1.092 genomas humanos. Naturaleza 491, 56–65 (2012).

Pacheco, TR et al. Diversidad del factor de empalme de vertebrados U2AF35: identificación de ARNm de U2AF1 empalmados alternativamente. J. Biol. Química. 279, 27039–27049 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kralovicova, J. & Vorechovsky, I. Reconocimiento dependiente de alelos del sitio de empalme 3 'del intrón 1 del INS. Hum. Gineta. 128, 383–400 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Malcolm Taylor (Universidad de Birmingham) e Ian Eperon (Universidad de Leicester) por la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a Ian Mockridge y Marta Larrayoz Ilundain (Universidad de Southampton) por su ayuda técnica. Agradecemos a Gideon Dreyfuss (Universidad de Pensilvania), Adrian Krainer (Laboratorio Cold Spring Harbor), Steven Marsh (UCL), Christopher Smith (Universidad de Cambridge) y Jonathan Strefford (Universidad de Southampton) por sus generosas donaciones de reactivos. Este trabajo fue apoyado por la subvención 12060 de Investigación sobre Leucemia y Linfoma para IV y NCPC. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Facultad de Medicina de la Universidad de Southampton, Southampton, SO16 6YD, Reino Unido

Jana Kralovicova, Marcin Knut, Nicholas CP Cross e Igor Vorechovsky

Wessex Regional Genetics Laboratory Salisbury Hospital, Salisbury, SP2 8BJ, Reino Unido

Nicolás CP Cruz

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JK y IV diseñaron y realizaron los experimentos. JK, MK y IV realizaron análisis bioinformáticos y estadísticos de datos experimentales y de RNA-Seq. NCPC contribuyó con muestras leucémicas y JK, MK, NCPC y IV escribieron el manuscrito.

Una parte de este trabajo está sujeta a una solicitud de patente en el Reino Unido. Los autores no declaran ningún otro interés financiero en conflicto.

Este trabajo está bajo una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; Si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

Kralovicova, J., Knut, M., Cross, N. et al. La regulación exoncéntrica de la expresión de ATM depende de la población y es susceptible de modificación antisentido mediante la focalización en pseudoexones. Representante científico 6, 18741 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18741

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Recibido: 06 de septiembre de 2015

Aceptado: 25 de noviembre de 2015

Publicado: 06 de enero de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18741

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